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定量蛋白质组
1、简介
Label-free即非标记定量技术,无需使用昂贵的稳定同位素标签做内部标准,只需分析大规模鉴定蛋白质时所产生的质谱数据,比较不同样品中相应肽段的信号强度,从而对肽段对应的蛋白质进行相对定量。
2、原理
非标定量法(Label-Free)是通过比较质谱分析次数或质谱峰强度,分析不同来源样品蛋白的数量变化,认为肽段在质谱中被捕获检测的频率与其在混合物中的丰度成正相关,因此蛋白质被质谱检测的计数反映了蛋白质的丰度,通过适当的数学公式可以将质谱检测计数与蛋白质的量联系起来,从而对蛋白质进行定量。按照其原理主要分为两种:第一种spectrum counts类的非标记方法,发展比较早,已经形成多种定量算法,但是主要的原理都是以MS2的鉴定结果为定量基础,各种方法的差别在于后期算法在大规模数据上的修正。第二种非标记定量的原理是以MS1为基础, 计算每个肽段的信号强度在LC-MS上的积分。

3、应用
疾病标志物筛选、疾病控制机制、药物作用靶点研究、发育机制研究、产量提高、作用机制研究、植物抗逆、营养吸收机制研究、稀有物种研究、特殊功能蛋白质筛选。

4、技术优势

A.无需昂贵的稳定同位素标签标记样本,实验成本低;
B.信息量大,样本数不受限制,可用于大规模数量样本检测;
C.对样本的操作较少,并且不受样品条件的限制,所需样本量低;
D.可以检测到的肽段动态范围可以达到4个数量级以上,提高了低丰度蛋白质的检测效率、非标记定量准确性。

5、送样要求

样品类型 送样要求
常规动物组织 15mg
坚硬动物组织 100mg
动物毛发 10mg
常规植物组织 100mg
木本植物的树根、树皮、树枝等 2g
果实种子 0.2g
花粉 100mg
微生物 100mg
动物细胞 1×10^7
血清、血浆 0.1ml
乳汁 1ml
脑脊液、关节液和淋巴液 0.2ml
唾液 0.05ml
泪液 100μl
尿液 5ml
分泌蛋白 5ml


 










 

1、简介
iTRAQ是美国AB Sciex公司研发的多肽体外标记定量技术, 采用8种或10种同位素标签,通过特异性标记多肽的氨基酸基团,
一次上机可实现8种或10种不同样本中蛋白质的相对定量,是近年来定量蛋白质组学常用的高通量筛选技术。

2、原理
iTRAQ试剂由三部分组成:报告基团(4标:114-117;8标:113-119和121)、质量平衡基团和肽反应标记试剂基团,形成4种或8种相对分子质量均等量(145或305)的异位标签。
iTRAQ试剂是可与氨基酸末端氨基及赖氨酸侧链氨基连接的胺标记同重元素。在质谱图中,任何一种iTRAQ试剂标记不同样本中的同一蛋白质表现为相同的质荷比。 在串联质谱中,信号离子表现为不同质荷比(113-119,121)的峰,因此根据波峰的高度及面积,可以鉴定出蛋白质和分析出同一蛋白质不同处理的定量信息。

3、应用
疾病标志物筛选、疾病控制机制、药物作用靶点研究、发育机制研究、产量提高、作用机制研究、植物抗逆、营养吸收机制研究、稀有物种研究、特殊功能蛋白质筛选

4、优势
A. 通量高,不受样本数目的限制
单次上机最多可以同时进行8个样品(iTRAQ)或10个样品(TMT)蛋白的鉴定和定量,
超过8个样品(iTRAQ)或10个样品(TMT)可以通过设置内参,形成搭桥,实现多次上机数据之间的比较,不受样本数目的限制。
B. 定量准确,重复性高
不同样本标记之后混样,统一处理、上机,与非标记定量样本单独处理、上机相比,
减少了样本处理和上机造成的实验误差,提高了定量的准确性和重复性。
C. 蛋白检测范围广
无物种特异性限制,理论上可用于所有物种。蛋白范围广,胞浆蛋白、膜蛋白、核蛋白、胞外蛋白、分泌蛋白等皆可检测。
蛋白丰度和分子质量跨度大,可检测出低丰度蛋白、强碱性蛋白、小于10KD或大于200KD的蛋白。

5、样品要求

样品类型 送样要求
常规动物组织 30mg
坚硬动物组织 200mg
动物毛发 20mg
常规植物组织 200mg
木本植物的树根、树皮、树枝等 5g
果实种子 0.5g
花粉 150mg
微生物 200mg
动物细胞 1×10^7
血清、血浆 0.2ml
乳汁 2ml
脑脊液、关节液和淋巴液 0.5ml
唾液 0.1ml
泪液 300μl
尿液 15ml
分泌蛋白 10ml



1、简介
DIA,数据非依赖性的扫描模式,是近几年来发展的一种新的质谱数据采集方式。
可以对特定质量范围内的所有母离子进行碎裂,采集所有母离子的碎片离子信息进行蛋白定性和定量。
相对于DDA(数据依赖性的扫描模式),DIA具有更好的准确性和可重复性。

2、原理

DIA 扫描模式中,利用超高分辨质谱对特定质量范围内的所有母离子进行碎裂,采集所有母离子的碎片离子,
并快速地依次扫描相邻的母离子窗口内的所有碎片离子。如,以25Da作为一个窗口,
先分离500-525Da这个范围的肽段,接下来采集525-550Da分子量范围的肽段,依次类推。